无菌室浮游菌测试操作规程

1  范围：

    本标准规定了医药工业无菌室和洁净区中浮游菌的测试条件和测试方法。

    本标准适用于医药工业无菌室和洁净区，无菌室或局部空气净化区域（包括洁净工作台）的浮游菌的测试和环境的验证。

2  引用标准：GB/T 16293.2010

    药品生产管理规范（1998修订）附录。

3  标准

4  测试方法

4.1  方法提要

本标本采用的方法是计数浓度法。即通过收集悬游在空气中的生物性粒子于专门的培养基（选择能证实其能够支持微生物生长的培养基），经若干时间和适宜的生长条件下让其繁殖到可见菌落计数，以判定该洁室的微生物浓度。

4.2人员的职责及培训

无菌室的测试人员应进行本专业的培训并获得相应的资格后才能才能履行对无菌室测试的职责，其中包含涉及的卫生知识和基本的微生物知识。

无菌室的测试人员应选择与生产操作的空气洁净度级别要求相适应的穿戴方式，外面的衣服不能带进100000级以上的区域。

4.3  仪器、辅助设备和培养基

选择合适的浮游菌采样器，包括采用无油的抽气泵，较低的气流流速和较大的采样流量，以保证培养基表面的水分布被吹干。

本测试需要具备仪器、辅助设备和培养基如下：

a) 浮游菌采样器；

b) 培养皿；

c) 高压消毒锅；

d) 培养基；

e) 恒温培养箱；  

4.4  浮游菌采样器原理

浮游菌采样器一般采用撞击法机理，可分为夹缝式采样器、离心式或针孔式采样器。夹缝式采样器由内部风机将气流吸入，通过采样器的夹缝式平板，将采集空气喷射并撞击到缓慢的平板培养基表面，附着的活微生物粒子经培养后形成菌落。离心式采样器由于内部风机的高速旋转，气流从才样器的前部进入后部流出，在离心力的作用下，空气中的活微生物粒子有足够的时间撞击到专用的固型培养条上，附着活的微生物粒子经培养后形成菌落。针孔式采样器是气流通过一个金属盖吸入，盖子上是密集的经过机械加工的特制小孔，通过风机将收集到的细小的空气直接撞击到平板培养基表面，附着的活物微生物粒子经培养成型后形成菌落。

4.5  测试要点

4.5.1  必须按照仪器的检定周期，定期对测试仪器作检定。应使用检定合格，并且使用有效期内的仪器。

4.5.2  测试仪器未进入被测区域时，若必需，则先清洗表面吧，或在相应的无菌室内准备和存放（用保护罩或其他适当地外罩保护仪器）。

4.5.3  在100级无菌室内用纸时，上面应蒙上一张透明不沾尘的覆盖物，在100级的无菌室内不能用铅笔的橡皮。

4.5.4  使用测试仪器时应严格按照说明书操作。

4.5.4.1  仪器开机，预热到稳定后，方可按说明书的规定对仪器进行校正，同时检查采样流量，并根据采样量设定时间。

4.5.4.2   采样口必须用使用便于消毒及化学性能稳定的材料制造。

4.5.4.3  采样管严禁渗漏，内壁应光滑。

4.5.4.4   采样管的长度应根据测点的高度定，尽量减少弯曲。

4.6   培养皿

4.6.1  一般采用φ90mm×15mm规格的培养皿。可根据所选用采样器选择合适的培养皿。

4.6.2离心式采样器采用专用的固型培养条

4.7  培养基

     大豆酪蛋白琼脂培养基（TSA）或沙氏培养基（SDA）或其他用户认可并经验证的培养基。

4.8 恒温培养箱

    必须定期对恒温培养箱进行效验

4.9  测试步骤；

4.9.1  测试前仪器、培养皿表面必须严格消毒。

4.9.1.1  采样器进入被测房间前先用消毒房间的消毒剂灭菌，用于100级无菌室的采样器

宜预先放在被测房间内。

4.9.1.2  用消毒剂擦净培养皿的外表面。

4.9.1.3  采样前，先用消毒剂消毒采样器的顶盖、转盘以及罩子的内外面，采样结束，再用消毒剂轻轻喷射罩子的内壁和转盘。

4.9.1.4  采样口及采样管，使用前必须高温灭菌。如用消毒剂对采样管的外壁及内壁进行消毒时，应将管中的残留液倒掉并晾干。

4.9.1.5  采样者应穿戴与被测洁净区域相应的工作服，在转盘上放入或调换培养皿前，双手用消毒剂消毒或带无菌手套操作。

4.9.1.6 采样仪器经消毒后先不放入培养皿，开启浮游菌采样器，使仪器中的残余消毒剂蒸发，时间不少于5min，并检查流量并根据采样量调整设定时间。

4.9.1.7 关闭浮游采样器，放入培养皿，盖上盖子。

4.9.1.8 置采样口于采样点后，开启浮游菌采样器进行采样。

4.10  培养

4.10.1  全部采样结束后，将培养皿倒置于恒温培养箱中培养。

4.10.2  采用大豆酪蛋白琼脂培养基（TSA）配制的培养经采样后，在30℃～35℃培养箱中培养，时间不得少于2d；采用沙氏培养基(SDA)配制的培养皿经采样后，在20℃～25℃培养箱中培养，时间不少于5d。

4.10.3每批培养基应有对照试验，检验培养基本身是否污染。可每批选定3只培养皿作对照培养。

4.11  菌落计数

4.11.1  用肉眼对培养皿上所有的菌落直接计数、标记或在菌落计数器上点计，然后用5～10倍放大镜检查，有否遗漏。

4.11.2  若平板上有2个或2个以上的菌落重叠，可分辩时仍以2个或2个以上菌落计数。

4.12  注意事项

4.12.1 使用前应仔细检查每个培养皿质量，培养基及培养皿有变质、破损或污染的不能用使用的。

4.12.2 对培养基、培养条件及其他参数作详细记录。

4.12.3 由于细菌种类繁多，差别甚大，计数时一般用透射光于培养皿面或真面仔细观察，不要有遗漏计培养皿边缘生长的菌落，并须要菌菌落或培养基沉淀的物区别，必要时用显微镜鉴别。

5  测试规则

5.1 测试条件

在测试之前要，要对无菌室相关参数进行预先测试，这类测试将会提供测试悬浮粒子的环境条件，例如：这种预先测试或可包括：

a)  温度和相对湿度的测试。  无菌室的温度和相对湿度应与其生产及工艺要求相适

应（无特殊要求时，温度控制在18℃～26℃，相对湿度控制在45%～65%之间为宜）。同时满

足测试仪器的使用范围；

b)  室内送风量或风速的测试的测试，或压差的测试；

c)  高效过滤器的泄漏测试

5.2  测试状态

    静态和动态两种状态均可进行测试。

静态测试时，室内测试人员不得多于2人

浮游菌测试前,被测定无菌室(区)由用户决定是否需要预先消毒.

    浮游菌测试时应标明测试时所采用的状态和室内测试人员数。

5.3  测试时间

5.3.1  在空态或静态a测试时，对单向流无菌室而言，测试宜在净化空气调节系统正常运行时间不少于10min后开始。对非单向流无菌室，测试宜在净化系统正常运行时间不少于30min后开始。在静态b测试时，对单向流洁净是（区），测试宜在生产操作人员撤离现场并经过10min自净后开始；；对非单向无菌室，测试宜在生产操作人员撤离现场并经过20min自净后开始。

5.3.2  在动态测试时，则须记录生产开始的时间以及测试时间。

5.4.浮游菌浓度的计算